近日，吉林农业大学林学与草学学院尚红梅教授团队在国际期刊《International Journal of Biological Macromolecules》（中国科学院一区，TOP期刊，IF：7.7）发表了题为“Pectin from comfrey roots alleviate DSS-induced ulcerative colitis in mice through modulating the intestinal barrier”的研究论文。该论文探讨了聚合草根果胶（CRP）通过改善肠道屏障功能缓解小鼠溃疡性结肠炎（UC）的作用。
本研究采用葡聚糖硫酸钠（DSS）建立小鼠UC模型，发现CRP灌胃治疗能够缓解UC小鼠体重减轻、腹泻和结肠长度缩短等相关症状。CRP能够抑制血清TNF-α和IL-6的过量分泌，升高血清IL-10水平。CRP治疗后，ZO-1、Muc2的mRNA表达水平升高。CRP组小鼠结肠上皮细胞恢复良好，粘膜层相对完整。CRP和5-氨基水杨酸（ASA）通过降低Oscillibacter、Alistipes和Anaeroplasma丰度，增加Lachnospiraceae_UCG-001丰度来调节肠道菌群，从而缓解小鼠UC症状。Rikenellaceae丰度与ZO-1 mRNA表达量呈正相关，Monoglobus丰度与Muc2 mRNA表达量呈正相关。这些结果表明，CRP可以修复肠道屏障，减轻由DSS引起的小鼠结肠损伤。
根据响应面设计优化出CRP提取工艺参数为pH 6.73，液料比19.50 mL/g，提取温度72.40 ℃，提取时间122 min。在此条件下，CRP得率为23.17%。按照最优工艺参数提取果胶，通过DEAE-52纤维素柱和Sepharose CL-6B柱纯化后得到CRP，浓缩后冷冻干燥，进一步研究其理化性质。CRP的分子量为1.03 × 104 Da（图1A）。根据单糖标准品色谱图（图1B）可知CRP由甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、鼠李糖（Rha）、半乳糖醛酸（GalA）和阿拉伯糖（Ara）组成（图1C）。Man、Rha、GalA、Glc、Gal、Ara的摩尔比为3.08:4.45:20.18:54.10:6.97:11.22。
图1 CRP分子量（A）和单糖组成
（B，单糖标准品；C，CRP单糖组成）
购入60只体重相近（18±2g）、6周龄SPF级雄性小鼠。所有小鼠自由饮水与采食，预饲1周后进入正式试验。试验第2周，对照组（CK）饮用蒸馏水，其余5组均饮用3% DSS溶液诱导UC。试验第3-4周，将6组小鼠进行灌胃处理，3个CRP组（L-CRP，100 mg/kg/体重；M-CRP，200 mg/kg/体重；H-CRP，400 mg/kg/体重）分别灌胃相应剂量CRP，ASA组灌胃ASA（150 mg/kg/体重），CK组和DSS组灌胃等剂量蒸馏水。在实验第31天，记录体重和结肠长度，采集小鼠血清、肝脏、脾脏和结肠，用于后续实验测定。
2.1 小鼠体重、疾病活动指数（DAI）、结肠长度
如图2A所示，在适应期（1-7d），各组小鼠体重没有变化。在饮用3% DSS期间（7-14d），与CK组相比，各组小鼠体重均明显下降。在给药期间（15-30d），各组小鼠体重均有增加趋势。与DSS组相比，L-CRP组能够缓解DSS引起的小鼠体重减轻。与CK组相比，其它5组小鼠饮用3% DSS后出现便血、体重减轻和严重腹泻（图2B）。与CK组比较，DSS组小鼠DAI评分较高，说明UC模型建立成功。L-CRP组小鼠DAI水平低于DSS组，说明L-CRP能有效缓解UC小鼠的腹泻、便血等相关症状。DSS诱导小鼠结肠缩短是肠道炎症严重程度的信号。如图2C-D所示，与CK组相比，DSS组小鼠的结肠长度明显缩短。ASA组和CRP组小鼠结肠长度与CK组比较无显著差异，说明ASA和CRP可缓解DSS所致的结肠长度缩短。
图2 CRP对小鼠表型的影响
A，体重；B，DAI评分；C，结肠图像；D，结肠长度
2.2 免疫屏障、机械屏障、化学屏障
与CK组相比，DSS组小鼠血清IL-6、TNF-α水平显著升高（P<0.05），IL-10水平降低（P<0.05）。CRP可通过降低促炎因子的表达，增强抗炎因子的表达来减轻DSS诱导的小鼠UC。H&E染色显示，CK组小鼠结肠组织完整，固有层未见炎症细胞浸润。DSS处理后小鼠结肠细胞结构被破坏，隐窝消失或扭曲，固有层可见大量炎性细胞浸润。而L-CRP组和M-CRP组结肠上皮细胞恢复良好，仅出现少量隐窝损伤和部分炎症细胞浸润（图3）。
图3 小鼠结肠组织病理染色（H&E）（100×）
A：CK 组；B：DSS 组；C：ASA 组；D：L-CRP 组；
E：M-CRP 组；F：H-CRP 组
如图4所示，DSS组Claudin-1、ZO-1、Occludin mRNA表达量较CK组显著降低（P<0.05），说明DSS诱导可造成小鼠结肠机械屏障损伤。与DSS组相比，ASA组、L-CRP组和H-CRP组ZO-1 mRNA表达量升高（P<0.05），H-CRP组Occludin mRNA表达量升高（P>0.05），说明添加CRP对肠屏障恢复有一定作用。
图4 小鼠结肠组织机械屏障蛋白和Muc2 mRNA水平
RT-qPCR结果表明（图4），L-CRP和M-CRP组Muc2 mRNA表达水平显著高于DSS组（P<0.05）。如图5所示，DSS处理后小鼠结肠杯状细胞减少，肠黏膜受损，肠粘液分泌不足。经CRP处理后，小鼠结肠杯状细胞数量增加，黏液层相对完整，黏蛋白分泌更广泛。综上所述，CRP可减轻DSS引起的小鼠肠黏膜损伤。
图5 小鼠结肠组织阿利新蓝-过碘酸-雪夫（AB-PAS）染色（100×）
A：CK 组；B：DSS 组；C：ASA 组；D：L-CRP 组；
E：M-CRP 组；F：H-CRP 组
2.3 生物屏障
与DSS组相比，M-CRP和H-CRP组降低了小鼠结肠内容物拟杆菌门的相对丰度，3个CRP组中厚壁菌门的相对丰度显著升高（P<0.05），从而提高了厚壁菌门与拟杆菌门的比值（F/B）（图6A）。CRP可以增加Lachnospiraceae_UCG-001的相对丰度，降低Oscillibacter和Alistipes相对丰度来缓解小鼠UC症状（图6B）。
图6 小鼠结肠菌群在门水平（A）和属水平（B）的相对丰度
DSS组主要标志物为Alistipes。L-CRP主要标志物为Lachnospiraceae_NK4A136_group。M-CRP组主要标志物为Dubosiella和Lachnoclostridium。H-CRP组主要标志物为Akkermansia和Lactobacillus（图7）。
图7 小鼠结肠菌群LDA评分
2.4 SCFAs和Spearman相关分析
乙酸可由纤维发酵产生，可以加强肠道屏障，促进肠道蠕动，防止有害细菌和条件致病菌的入侵。L-CRP组乙酸浓度显著高于DSS组（P<0.05），与CK组接近，说明CRP可通过调节乙酸浓度减轻小鼠UC（图8A-D）。Rikenellaceae与ZO-1 mRNA表达量呈正相关，Monoglobus与Muc2 mRNA表达量呈正相关（图8E）。
图8 小鼠结肠内容物中短链脂肪酸（SCFAs）浓度与Spearman相关性分析
A，乙酸；B，丙酸；C，丁酸；D，总酸；
E，Spearman相关分析
动物实验表明，CRP可降低小鼠DAI，抑制DSS诱导的结肠缩短和促炎因子TNF-α、IL-6的过量分泌，提高抑炎因子IL-10水平。CRP组小鼠结肠上皮细胞恢复良好，杯状细胞数量增多，粘膜层相对完整，CRP可减轻DSS诱导的病理损伤。CRP处理后，小鼠结肠乙酸含量升高，ZO-1和Muc2 mRNA表达水平上调。CRP还能调节小鼠肠道菌群的含量，恢复Lachnospiraceae UCG-001相对丰度，降低Oscillibacter、Alistipes相对丰度，抑制UC小鼠结肠菌群生态失衡。这些结果表明，CRP可通过调节小鼠肠道菌群和改善肠道屏障来缓解DSS诱导的UC。
本论文通讯作者为吉林农业大学林学与草学学院尚红梅教授，第一作者为草学专业在读硕士研究生刘梦雪。本研究得到了吉林省科技厅重点研发项目（20230202072NC）的资助。
论文链接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.137016
